Barwienie metodą Grama jest techniką szybką i służy do obserwowania obecności bakterii w próbce tkanki i klasyfikacji bakterii jako Gram-dodatnie lub Gram-ujemne na podstawie chemicznych i fizycznych właściwości ich ścian komórkowych. Barwienie Grama jest prawie zawsze stosowane jako pierwszy krok w diagnozowaniu infekcji bakteryjnej.
Ta technika barwienia została nazwana na cześć duńskiego naukowca Hansa Christiana Grama (1853 - 1938), który opracował ją w 1882 i opublikował w 1884 jako technikę rozróżniania dwóch typów bakterii o podobnych objawach klinicznych: Streptococcus pneumoniae (znany również jako Streptococcus pneumoniae), pneumokoki) i bakterie Klebsiella pneumoniae.
Krok
Metoda 1 z 3: Przygotowanie szkiełka mikroskopowego
Krok 1. Przygotuj się do pracy w laboratorium
Załóż rękawiczki i długą gumkę do włosów, aby zapobiec skażeniu bakteryjnym badanej próbki. Wyczyść miejsce pracy pod wyciągiem lub w innym dobrze wentylowanym miejscu. Przed rozpoczęciem sprawdź palnik Bunsena i upewnij się, że mikroskop działa prawidłowo.
Krok 2. Wysterylizuj szkiełko mikroskopowe
Jeśli szkiełko jest brudne, umyj go wodą z mydłem, aby usunąć olej i brud. Wyczyść szkiełka etanolem, środkiem do czyszczenia szkła lub inną metodą stosowaną w laboratorium.
Krok 3. Umieść próbkę na szkiełku
Możesz użyć techniki barwienia Grama, aby zidentyfikować bakterie w próbce medycznej lub kulturę bakterii rosnącą na szalce Petriego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj barwnika Grama na cienkich pociągnięciach próbki. Zaleca się używanie próbek, które mają mniej niż 24 godziny, ponieważ starsze bakterie mogą uszkodzić ściany komórkowe i mogą nie reagować na barwienie Grama.
- Jeśli używasz próbki tkanki, dodaj 1-2 krople do szklanego szkiełka. Rozprowadzić równomiernie na szkiełku, aby uformować cienką warstwę próbki, przesuwając ją po krawędzi drugiego sterylnego szkiełka. Pozwól mu wyschnąć przed wykonaniem następnego kroku.
- Jeśli pobierasz bakterie z szalki Petriego, wysterylizuj ezę w palniku Bunsena, aż się zaświeci, a następnie pozostaw do ostygnięcia. Użyj ezy do nakroplenia sterylnej wody na szkiełko, a następnie wysterylizuj i ponownie schłodź przed użyciem do pobrania małej próbki bakterii. Następnie delikatnie wymieszaj.
- Bakterie przygotowane w bulionie należy ponownie wymieszać za pomocą wirówki, a następnie przenieść ezą do posiewu jak powyżej, bez dodawania wody.
- Jeśli masz próbkę wymazówki (zwykle robi się to za pomocą małego, zakończonego bawełnianą rączką), dotknij i delikatnie obracaj wymazówką nad szkiełkiem.
Krok 4. Lekko wysoka temperatura może dać dobry rozmaz
Ciepło utrzyma bakterie na szkiełku, dzięki czemu nie rozpuszczają się one łatwo podczas procesu barwienia. Stuknij slajd szybko dwa do trzech razy nad palnikiem Bunsena lub podgrzej slajd na elektrycznym podgrzewaczu slajdów. Nie przegrzewaj, próbka może ulec uszkodzeniu. Jeśli używasz palnika Bunsena, powinien to być mały, ale niebieski płomień zamiast dużego, pomarańczowego płomienia.
Alternatywnie rozmaz można również wykonać z metanolem, dodając 1-2 krople metanolu do suchego rozmazu, susząc pozostały metanol na szkiełku przez pozostawienie go na wolnym powietrzu. Ta technika minimalizuje uszkodzenia komórek i zapewnia czyste tło obrazu slajdu
Krok 5. Umieść slajd na tacce do kolorowania
Tacki do barwienia wykonane są z metalowych, szklanych lub płytkich plastikowych płyt z miękką siatką wyściełaną od góry. Umieść slajdy na wierzchu tych siatek, aby płyn, którego używasz, mógł zostać spuszczony do tacy.
Jeśli nie masz tacy do kolorowania, możesz umieścić slajd na plastikowej tacy, aby wydrukować kostki lodu
Metoda 2 z 3: Proces barwienia metodą Grama
Krok 1. Wylej płyn w postaci fioletu krystalicznego na rozmaz
Za pomocą pipety spryskaj próbkę bakterii kilkoma kroplami fioletu krystalicznego, zwanego również fioletem gencjanowym. Pozostaw na 30-60 sekund. Fiolet krystaliczny (KV) rozdziela się w roztworze wodnym na jony KV+ i chlorkowe (Cl-). Jony te przenikają przez ściany komórkowe i błony komórkowe bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Jon KV+ oddziałuje z ujemnie naładowanymi składnikami komórek bakteryjnych, nadając komórkom purpurowy kolor.
Wiele laboratoriów używa fioletu krystalicznego „Hucker”, który zawiera szczawian amonu, aby zapobiec wytrącaniu
Krok 2. Delikatnie spłucz fiolet krystaliczny
Przechyl szkiełko i użyj spryskiwacza, aby spryskać szkiełko małym strumieniem wody destylowanej lub z kranu. Woda powinna spływać po powierzchni rozmazu i nie powinna być rozpylana bezpośrednio na rozmaz. Nie spłukuj nadmiernie. Może usuwać przebarwienia bakterii Gram-dodatnich.
Krok 3. Spłucz rozmaz jodem, a następnie spłucz
Użyj zakraplacza, aby spłukać rozmaz jodem. Pozostaw na co najmniej 60 sekund, a następnie dokładnie spłucz w ten sam sposób, jak powyżej. Jod w postaci ujemnie naładowanego jonu oddziałuje z KV+ tworząc duży kompleks złożony pomiędzy fioletem krystalicznym a jodem (kompleks związku CV-I) w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie komórki. Ten kompleks związków zachowa fioletową barwę fioletu krystalicznego wewnątrz komórki, w zabarwionych miejscach.
Jod jest substancją żrącą. Unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą
Krok 4. Dodaj wybielacz do koloru, a następnie szybko spłucz
Do tego ważnego etapu zwykle stosuje się mieszaninę 1:1 acetonu i etanolu, który należy starannie zaplanować. Ustaw szkiełko pod odpowiednim kątem, a następnie dodaj kolorowy wybielacz, aż w wodzie używanej do płukania nie będzie już widać fioletu. Zwykle zajmuje to mniej niż 10 sekund, a nawet mniej czasu, jeśli wybielacz zawiera wysokie stężenie acetonu. Natychmiast przerwij ten krok, w przeciwnym razie barwnik wypłucze również fiolet krystaliczny z komórek Gram-dodatnich i ujemnych, a proces barwienia należy powtórzyć. Natychmiast spłucz nadmiar wybielacza do koloru, stosując poprzednią technikę.
- Czysty aceton (95%+) może być użyty jako substytut. Im więcej acetonu użyjesz, tym szybciej zadziała wybielacz, więc musisz zwracać większą uwagę na czas.
- Jeśli masz problem ze śledzeniem czasu na ten krok, dodaj kropla po kropli wybielacza kolorowego.
Krok 5. Posyp rozmaz barwnikiem, a następnie spłucz
Barwienie kontrastowe, zwykle safranina lub fuksyna, służy do zwiększenia kontrastu między bakteriami Gram-ujemnymi i Gram-dodatnimi, poprzez barwienie odbarwionych (odbarwionych) bakterii, tj. bakterii Gram-ujemnych, na kolor różowy lub czerwony. Pozostawić na co najmniej 45 sekund, następnie spłucz.
Fuksyna intensywnie barwi wiele bakterii Gram-ujemnych, takich jak Haemophilus spp i Legionella spp. Ta metoda jest dobra dla początkujących
Krok 6. Wysuszyć szkiełko
Można je wysuszyć na wolnym powietrzu lub wysuszyć za pomocą sprzedawanego do tego celu bibulicznego bibuły. Proces barwienia metodą Grama jest zakończony.
Metoda 3 z 3: Sprawdzanie wyników kolorowania
Krok 1. Przygotuj mikroskop świetlny
Umieść szkiełko pod mikroskopem. Bakterie różnią się znacznie wielkością, więc całkowite wymagane powiększenie będzie się wahać od 400x do 1000x. Aby uzyskać ostrzejszy obraz, zaleca się obiektyw z olejkiem immersyjnym. Upuść olejek immersyjny na szkiełko, unikając ruchu podczas kapania, aby zapobiec tworzeniu się bąbelków. Przesuń uchwyt soczewki mikroskopu tak, aby soczewka obiektywu zatrzasnęła się na swoim miejscu i dotknęła oleju.
Immersję olejową można stosować tylko na specjalnie zaprojektowanych soczewkach, a nie na „suchych” soczewkach
Krok 2. Spróbuj zidentyfikować bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne
Zbadaj szkiełko pod mikroskopem świetlnym. Bakterie Gram-dodatnie mają kolor fioletowy, ponieważ fiolet krystaliczny jest uwięziony w grubej ścianie komórkowej. Bakterie Gram-ujemne będą miały różową lub czerwoną barwę, ponieważ fiolet krystaliczny jest wypłukiwany przez cienkie ściany komórkowe, gdzie wnika różowy przeciwbarwnik.
- Jeśli próbka jest zbyt gruba, wynik może być fałszywie dodatni. Wybarwij nową próbkę, jeśli zawiera wszystkie bakterie Gram-dodatnie, aby upewnić się, że wynik jest prawidłowy.
- Jeśli użyjesz zbyt dużej ilości wybielacza do koloru, wynik może być fałszywie negatywny. Wybarwij nową próbkę, jeśli zawiera wszystkie bakterie Gram-ujemne, aby upewnić się, że wynik jest prawidłowy.
Krok 3. Porównaj widoczne wyniki z obrazem referencyjnym
Jeśli nie wiesz, jak wyglądają bakterie, przestudiuj kolekcję obrazów referencyjnych, zwykle posortowanych według kształtu i barwienia Grama. Możesz także przeglądać internetowe bazy danych w [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos i wielu innych witrynach internetowych. Aby ułatwić identyfikację, poniżej znajdują się przykłady bakterii, które są powszechnie spotykane lub ważne dla diagnozy, sklasyfikowane według ich statusu Grama i kształtu.
Krok 4. Zidentyfikuj bakterie gram-dodatnie na podstawie ich kształtu
Bakterie są dalej klasyfikowane według ich kształtu pod mikroskopem, najczęściej jako ziarniaki (kuliste) lub pręciki (cylindryczne). Oto kilka przykładów bakterii Gram-dodatnich (w kolorze fioletowym) w zależności od ich kształtu:
- Gram-dodatnie kokcy zwykle gronkowce (czyli ziarniaki grupy) lub paciorkowce (czyli ziarniaki łańcuchowe).
- Gram-dodatnie pałeczki, takie jak Bacillus, Clostridium, Corynebacterium i Listeria. Bakterie pałeczki Actinomyces spp. zwykle mają gałęzie lub włókna.
Krok 5. Zidentyfikuj bakterie Gram-ujemne
Bakterie Gram-ujemne (różowe) często dzieli się na trzy grupy. Cocci mają kulisty kształt, pręciki są długie i cienkie, a kokoidowe są pomiędzy.
- Cocci Gram-ujemne Najczęstszym jest Neisseria spp.
- pałeczki Gram-ujemne np. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas i wiele innych. Vibrio cholerae może być postrzegana jako zwykła łodyga lub wygięta łodyga.
- Gram-ujemne „kokoidy” (lub „coccobacilli”) pręciki np. Bordetella, Brucella, Haemophilus i Pasteurella
Krok 6. Sprawdź dokładnie, czy wyniki są mieszane
Niektóre bakterie są trudne do precyzyjnego zabarwienia ze względu na kruchość lub woskowatą naturę ich ścian komórkowych. Bakterie te mogą wykazywać mieszankę fioletu lub różu w tej samej komórce lub między różnymi komórkami w tym samym rozmazie. Próbki bakteryjne starsze niż 24 godziny mogą wykazywać ten problem, ale istnieją również gatunki bakterii, które pozostają trudne do zabarwienia w każdym wieku pobierania próbek. Bakterie te wymagają bardziej specjalistycznych testów do identyfikacji, takich jak barwienie kwasooporne, obserwacja w kulturze bakteryjnej, pożywka hodowlana TSI lub testy genetyczne.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium i Propionibacterium spp. wszystkie są bakteriami Gram-dodatnimi, ale często nie są wyraźnie wybarwione.
- Małe, smukłe bakterie, takie jak Treponema, Chlamydia i Rickettsia spp. trudne do barwienia metodą Grama.
Krok 7. Wyrzuć wszelkie pozostałe materiały eksploatacyjne i sprzęt
Ta procedura usuwania odpadów różni się w zależności od laboratorium i zależy od użytych materiałów. Zazwyczaj płyn w tacce do barwienia jest usuwany do butelek oznaczonych jako odpady niebezpieczne. Namoczyć preparaty w 10% roztworze wybielacza, a następnie wyrzucić do pojemnika na ostre przedmioty.
Porady
- Pamiętaj, że wyniki barwienia metodą Grama będą dobre tylko wtedy, gdy próbka jest dobra. Ważne jest poinformowanie pacjentów, aby mogli dostarczyć dobrą próbkę (np. różnica między pluciem a głębokim kaszlem w celu uzyskania próbki plwociny).
- Jako kolorowy wybielacz etanol reaguje wolniej niż aceton.
- Przestrzegaj standardowych przepisów laboratoryjnych, aby zapewnić bezpieczeństwo.
- Do ćwiczeń używaj wymazu z policzka, ponieważ zawiera on zarówno bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne. Jeśli widzisz tylko jeden rodzaj bakterii, możesz używać za mało lub za dużo wybielacza.
- Do zabezpieczenia zjeżdżalni można użyć drewnianych klamer.
Ostrzeżenie
- Aceton i etanol to substancje palne. Aceton usunie olej z rąk, ułatwiając skórze wchłanianie innych chemikaliów. Noś rękawiczki i używaj ich ostrożnie.
- Nie pozwól rozmazowi wyschnąć przed spłukaniem plamy Grama lub barwienia kontrastowego.
Czego potrzebujesz
- Próbka sieci
- Szklana zjeżdżalnia
- Pipeta
- Małe źródło ognia lub podgrzewacz suwakowy lub metanol
- Woda
- Krystaliczny fiolet
- Jod
- Wybielacz do kolorów, taki jak alkohol lub aceton
- Safranin
